Sabtu, 08 Desember 2012

PEWARNAAN GRAM


PEWARNAAN GRAM
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, termasuk bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk melihat dan mengamati bentuk sel bakteri  dalam keadaan hidup sangat sulit, sehingga untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi (Jawetz 2008).
Struktur di dalam sel pada tempat-tempat yang dibentuk oleh spesies ini, disebut endospora. Endospora dapat bertahan hidup dalam keadaan kekurangan nutrien, tahan terhadap panas, kekeringan, radiasi UV serta bahan-bahan kimia. Ketahanan tersebut disebabkan oleh adanya selubung spora yang tebal dan keras. Sifat-sifat ini menyebabkan dibutuhkannya perlakuan yang keras untuk mewarnainya. Hanya bila diperlukan panas yang cukup, pewarna yang sesuai dapat menembus endospora. Tetapi sekali pewarna memasuki endospora, sukar untuk dihilangkan. Ukuran dan letak endospora di dalam sel merupakan ciri-ciri yang digunakan untuk membedakan spesies-spesies bakteri yang membentuknya (Prescott 2008).
Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies.
Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan negatif, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel microbe atau bagian-bagian sel microbe disebut teknik pewarnaan diferensial. Sedangkan pengecatan struktural hanya mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan bagian-bagian dari sel. Termasuk dalam pengecatan ini adalah pengecatan endospora, flagella dan pengecatan kapsul (Bailey  2007).
Tujuan
Tujuan praktikum ini  adalah untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel.
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam praktium ini adalah kaca objek, kawat ose, botol semprot, mikroskop dan tisue.
Bahan yang digunakan alat sampel, kristal ungu, iodin, alkohol 96%, safranin dan malacid green.
Prosedur
Pewarnaan gram dilakukan dengan cara sampel diambil dengan kawat ose dan sebar ratakan di atas kaca objek, lalu difiksasi dengan udara dan panas di atas bunsen. 2 tetes kristal ungun diteteskan dan direndam selama 1 menit, lalu dibilas dengan air mengalir dan dan dikering udarakan. 2 tetes iodin ditambahkan dan direndam selama 1 menit lalu bilas kembali dengan air mengalir dan keringkan kembali. Kemudian dicuci dengan alkohol 96% selama 30 detik direndam, dibilas kemudain dikeringkan kembali. 2 tetes safranin diteteskan dan diremdan selama 30 detik, dibilas dan dikeringkan. Kaca objek diamati dibawah mikroskop.
Pewarnaan spora dilakukan dengan cara sampel diambil dengan menggunakan kawat ose dan disebar ratakan di atas kaca objek, sebanyak 2 tetes malacite green ditambahkan dan direndam 2-3 menit kemudian dihangatkan. Kaca objek dibilas dengan akuades dan dikeringkan. Sebanyak 2 tetes safranin di tambahkan kemudian dibilas kembali dengan akuades kemudian keringkan kembali dan amati di bawah mikroskop.
Data dan Hasil Pengamatan
Sampel
Gram
Morfologi Sel
Morfologi Koloni
1
(-)
Bacil
Monobacil
2
(-)
Cocus
Diplococus
3
(-)
Bacil
Streptobacil
4
(-)
Bacil
Monobacil
5
(-)
Basil
Streptobasil
Keterangan : Gram Negatif (-) : berwarna merah
                      Gram Positif (+) : berwarna ungu

Pembahasan
Pewarnaan garam adalah suatu metode untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar , yakni gram positif dan gram negatif. berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae (Iud W 2008).
Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteribakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram (Entjang I 2003).
Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri. Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen blue, safranin, netral red, dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4 -, CH3COO-, COOHCOO. Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagianbagian inti sel. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti : fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Pada bakteri gram positif menunjukkan warna biru ungu dan bakteri gram negatif berwarna merah.
Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :
1.      Zat warna utama (violet kristal)
2.      Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama
3.      Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan uantuk melunturkan zat warna utama
4.      Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.
Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.
Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu :
1.      Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.
2.      Pengintesifan cat utama dengan penambahan iod.
3.      Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol 96%.
4.      Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin.
Pada proses pewarnaan gram, harus gelas obyek yang bersih. Pembersihan ini dilakukan supaya gelas obyek bebas lemak dan debu. Pembersihan biasanya  menggunakan alkohol . Setelah di cuci kemudian di beri satu tetes aquades pada permukaan gelas obyek. Kultur bakteri murni diambil dan diratakan diatas kaca obyek. Pengambilan kultur bakteri tidak diambil terlalu banyak, karena jika terlalu banyak akan sulit diratakan dan apabila kultur bakteri tidak dapat diratakan tipis-tipis maka bakteri akan tertimbun hal ini akan mengakibatkan pemeriksaan bentuknya satu per satu menjadi tidak jelas.
Apabila sudah kering, dilakukan fiksasi dengan cara melewatkan diatas nyala api. Proses fiksasi dilakukan supaya bakteri benar-benar melekat pada kaca obyek sehingga olesan bakteri tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Yang perlu diperhatikan dalam proses fiksasi adalah bidang yang mengandung bakteri dijaga agar tidak terkena nyala api. Setelah dilakukan fiksasi kemudian ditetesi dengan kristal violet dan dibiarkan. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan dibiarkan sampai kering (dengan cara dianginkan). Pencucian dengan air bertujuan untuk mengurangi kelebihan zat warna dari violet kristal. Setelah kelebihan zat warna dicuci dengan air kemudian diberi larutan iodin dan dibiarkan sehingga terbentuk suatu kompleks antara violet kristal dan iodin. Olesan bakteri kemudian dicuci kembali dengan air mengalir. Kemudian dicuci dengan etanol dan dicuci kembali dengan air mengalir.
Pewarnaan selanjutnya dengan menggunakan safranin dan diamkan. Kemudian cuci dengan air mengalir dan kering dianginkan, kemudian diamati dibawah mikroskop.
Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negative mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Pemberian alkohol (etanol) pada praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu.
Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel  dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).
Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif.
Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:
1.      Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.
2.      Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam.
3.      lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit ± 10% dari berat kering, tidak mengandung asam tekoat.
4.      Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
5.      Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.
6.      Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.
7.      Tidak resisten terhadap gangguan fisik.
8.      Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat.
9.      Peka terhadap streptomisin.
10.  Toksin yang dibentuk Endotoksin.

Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:
1.      Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.
2.      Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat.
3.      Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.
4.      Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.
5.      Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.
6.      Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
7.      Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut.
8.      Tidak peka terhadap streptomisin.
9.      Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin
Berdasarkan pengamatan pada sampel 1 morfologi sel berbentuk bacil dan morfologi koloni streptobasil, sampel 2 morfologi sel berbentuk cocus dan morfologi koloni streptococus, sampel 3 morfologi sel berbentuk bacil dan morfologi koloni streptobacil, sampel 4 morfologi sel berbentuk bacil dan morfologi koloni streptobasil dan sampel 5 morfologi sel berbentuk bacil dan morfologi koloni streptobasil.
Simpulan
Berdasarkan pengamatan dapat disimpulkan bahwa pada sampel 1 morfologi sel berbentuk bacil dan morfologi koloni streptobasil, sampel 2 morfologi sel berbentuk cocus dan morfologi koloni streptococus, sampel 3 morfologi sel berbentuk bacil dan morfologi koloni streptobacil, sampel 4 morfologi sel berbentuk bacil dan morfologi koloni streptobasil dan sampel 5 morfologi sel berbentuk bacil dan morfologi koloni streptobasil.


Daftar Pustaka
Bailey and Scott’s. 2007. Diagnostic Microbiology 12th edition. Mosby Elsevier : Houston.
Entjang I.  2003. Mikrobiologi dan Parasitologi Untuk Akademi Keperawatan. Jakarta : PT. Citra Aditya Bakti
Iud W. 2008. Teknik dan Metode Dasar Dalam Mikrobiologi. Malang : UMM Press
Jawetz, Melnick, Adelberg. 2008. Mikrobiologi Kedokteran Edisi 23. Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC
Prescott, Harley, Klein’s. 2008. Microbiology 7th edition. Boston : Published by McGraw-Hill



0 komentar:

Poskan Komentar