ELISA
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia
yang terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran
antibodi atau antigen dalam suatu sampel. ELISA telah digunakan sebagai alat
diagnostik dalam bidang medis, patologi tumbuhan, dan juga berbagai bidang
industri.
Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas
untuk antigen tertentu. Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui
diimobilisasi pada suatu permukaan solid (biasanya berupa lempeng mikrotiter
polistirene), baik yang non-spesifik (melalui penyerapan pada permukaan) atau
spesifik (melalui penangkapan oleh antibodi lain yang spesifik untuk
antigen yang sama, disebut ‘sandwich’ ELISA).
Setelah antigen diimobilisasi, antibodi pendeteksi ditambahkan, membentuk
kompleks dengan antigen. Antibodi pendeteksi dapat berikatan juga dengan enzim,
atau dapat dideteksi secara langsung oleh antibodi sekunder yang
berikatan dengan enzim melalui biokonjugasi. Di antara tiap tahap, plate harus dicuci
dengan larutan deterjen lembut untuk membuang kelebihan protein atau antibodi
yang tidak terikat. Setelah tahap pencucian terakhir, dalam plate ditambahkan
substrat enzimatik untuk memproduksi sinyal yang visibel, yang
menunjukkan kuantitas antigen dalam sampel. Teknik ELISA yang lama
menggunakan substrat kromogenik, meskipun metode-metode terbaru mengembangkan
substrat fluorogenik yang jauh lebih sensitif.
Aplikasi ELISA
ELISA dapat mengevaluasi kehadiran antigen dan antibodi dalam suatu sampel,
karenanya merupakan metode yang sangat berguna untuk menentukan
konsentrasi antibodi dalam serum (seperti dalam tes HIV), dan juga
untuk mendeteksi adanya antigen. Metode ini juga bisa diaplikasikan dalam
indiustri makanan untuk mendeteksi allergen potensial dalam makanan seperti
susu, kacang, walnut, almond, dan telur. ELISA juga dapat digunakan dalam
bidang toksikologi untuk uji pendugaan cepat pada berbagai kelas obat.
Beberapa Tipe ELISA
A. Indirect ELISA
Tahap umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk menentukan konsentrasi antibodidalam serum adalah:
1. Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya
ditempelkan pada permukaan lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan
menempel pada permukaan plastik dengan cara adsorpsi. Sampel dari konsentrasi
antigen yang diketahui ini akan menetapkan kurva standar yang digunakan
untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu sampel yang akan diuji.
2. Suatu larutan pekat dari protein non-interacting, seperti bovine serum albumin (BSA) atau kasein, ditambahkan dalam semua lubang plate mikrotiter.
Tahap ini dikenal sebagai blocking, karena protein serum memblok adsorpsi non-spesifik dari protein lain ke plate.
3. Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel serum dari
antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama dengan yang
digunakan untuk antigen standar. Karena imobilisasi antigen dalam tahap ini
terjadi karena adsorpsi non-spesifik, maka konsentrasi protein total harus sama
dengan antigen standar.
4. Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji
dimasukkan dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen
terimobilisasi pada permukaan lubang, bukan pada protein serum yang lain atau
protein yang terbloking.
5. Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi,
ditambahkan dalam lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi enzim
dengan substrat spesifik. Tahap ini bisa dilewati jika antibodi pendeteksi berkonjugasi
dengan enzim.
6. Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi yang tidak terikat.
7. Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan sinyal
kromogenik/ fluorogenik/ elektrokimia.
8. Hasil dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer atau
alat optik/ elektrokimia lainnya.
Enzim bertindak sebagai amplifier, bahkan jika hanya sedikit antibodi
terikat enzim yang tetap terikat, molekul enzim akan memproduksi berbagai
molekul sinyal. Kerugian utama dari metodeindirect ELISA adalah metode imobilisasi antigennya non-spesifik, sehingga setiap
protein pada sampel akan menempel pada lubang plate mikrotiter, sehingga konsentrasi
analit yang kecil dalam sampel harus berkompetisi dengan protein serum lain
saat pengikatan pada permukaan lubang. Mekanisme indirect ELISA dapat dilihat pada gambar di
bawah ini.
2. Sandwich ELISA (untuk ujian besok pelajari yang ini saja)
Tahapan dalam Sandwich ELISA adalah sebagai berikut:
1. Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi ‘penangkap’
2. Semua non spesifik binding
sites pada permukaan diblokir
3. Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate
4. Plate dicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak
terikat
5. Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan secara spesifik dengan
antigen
6. Antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim dimasukkan, yang akan
berikatan dengan antibodi primer
7. Plate dicuci, sehingga konjugat antibodi-enzim yang tidak
terikat dapat dibuang
8. Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal berwarna/
berfluoresensi/ elektrokimia
9. Diukur absorbansinya untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari
antigen
Keuntungan utama dari metode sandwich ELISA adalah kemampuannya menguji sampel yang tidak murni, dan mampu
mengikat secara selektif antigen yang dikehendaki. Tanpa lapisan pertama
antibodi penangkap, semua jenis protein pada sampel (termasuk protein serum)
dapat diserap secara kompetitif oleh permukaan lempeng, menurunkan kuantitas
antigen yang terimobilisasi. Prinsip kerja sandwich ELISA dapat dilihat pada skema
berikut ini:
3. ELISA kompetitif
Tahapan pengerjaan ELISA kompetitif berbeda dari dua metode yang telah
dibahas sebelumnya, yaitu:
1. Antibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennya
2. Komplek antigen-antibodi ini selanjutnya ditambahkan pada lubang yang telah
dilapisi antigen
3. Plate dicuci, sehingga kelebihan antibodi tercuci (semakin
banyak antigen dalam sampel, semakin sedikit antibodi yang dapat terikat pada
antigen yang menempel pada permukaan lubang, karena inilah disebut kompetisi
4. Ditambahkan antibodi sekunder yang spesifik utnuk antibodi primer. Antibodi
sekunder ini berpasangan dengan enzim
5. Substrat ditambahkan, enzim akan mengubah substrat menjadi sinyal
kromogenik/ fluoresensi.
Dalam ELISA kompetitif, semakin tinggi konsentrasi antigen orisinal,
semakin lemah sinyal yang dihasilkan. Prinsip kerjanya dapat dilihat pada
gambar berikut ini:
Secara singkat tahapan kerja dalam metode ELISA dapat digambarkan sebagai
berikut:
0 komentar:
Posting Komentar