PEWARNAAN GRAM
Mikroorganisme
yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas,
termasuk bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan
air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk
melihat dan mengamati bentuk sel bakteri dalam keadaan hidup sangat
sulit, sehingga untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau
pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Hal
tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui
reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan. Oleh karena itu
teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling utama
dalam penelitian-penelitian mikrobiologi (Jawetz 2008).
Struktur di
dalam sel pada tempat-tempat yang dibentuk oleh spesies ini, disebut endospora.
Endospora dapat bertahan hidup dalam keadaan kekurangan nutrien, tahan terhadap
panas, kekeringan, radiasi UV serta bahan-bahan kimia. Ketahanan tersebut
disebabkan oleh adanya selubung spora yang tebal dan keras. Sifat-sifat ini
menyebabkan dibutuhkannya perlakuan yang keras untuk mewarnainya. Hanya bila
diperlukan panas yang cukup, pewarna yang sesuai dapat menembus endospora.
Tetapi sekali pewarna memasuki endospora, sukar untuk dihilangkan. Ukuran dan
letak endospora di dalam sel merupakan ciri-ciri yang digunakan untuk
membedakan spesies-spesies bakteri yang membentuknya (Prescott 2008).
Faktor-faktor
yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat,
intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang
sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat
warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam
encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini
merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies.
Teknik
pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat macam yaitu
pengecatan sederhana, pengecatan negatif, pengecatan diferensial dan pengecatan
struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan
menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang
sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang
menampilkan perbedaan di antara sel-sel microbe atau bagian-bagian sel microbe
disebut teknik pewarnaan diferensial. Sedangkan pengecatan struktural hanya
mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan bagian-bagian dari sel.
Termasuk dalam pengecatan ini adalah pengecatan endospora, flagella dan
pengecatan kapsul (Bailey 2007).
Tujuan
Tujuan
praktikum ini adalah untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop,
memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur
dalam bakteri seperti dinding sel.
Alat dan Bahan
Alat yang
digunakan dalam praktium ini adalah kaca objek, kawat ose, botol semprot,
mikroskop dan tisue.
Bahan yang
digunakan alat sampel, kristal ungu, iodin, alkohol 96%, safranin dan malacid
green.
Prosedur
Pewarnaan
gram dilakukan dengan cara sampel diambil dengan kawat ose dan sebar ratakan di
atas kaca objek, lalu difiksasi dengan udara dan panas di atas bunsen. 2 tetes
kristal ungun diteteskan dan direndam selama 1 menit, lalu dibilas dengan air
mengalir dan dan dikering udarakan. 2 tetes iodin ditambahkan dan direndam
selama 1 menit lalu bilas kembali dengan air mengalir dan keringkan kembali.
Kemudian dicuci dengan alkohol 96% selama 30 detik direndam, dibilas kemudain
dikeringkan kembali. 2 tetes safranin diteteskan dan diremdan selama 30 detik,
dibilas dan dikeringkan. Kaca objek diamati dibawah mikroskop.
Pewarnaan
spora dilakukan dengan cara sampel diambil dengan menggunakan kawat ose dan
disebar ratakan di atas kaca objek, sebanyak 2 tetes malacite green ditambahkan
dan direndam 2-3 menit kemudian dihangatkan. Kaca objek dibilas dengan akuades
dan dikeringkan. Sebanyak 2 tetes safranin di tambahkan kemudian dibilas
kembali dengan akuades kemudian keringkan kembali dan amati di bawah mikroskop.
Data dan
Hasil Pengamatan
Sampel
|
Gram
|
Morfologi
Sel
|
Morfologi
Koloni
|
1
|
(-)
|
Bacil
|
Monobacil
|
2
|
(-)
|
Cocus
|
Diplococus
|
3
|
(-)
|
Bacil
|
Streptobacil
|
4
|
(-)
|
Bacil
|
Monobacil
|
5
|
(-)
|
Basil
|
Streptobasil
|
Keterangan :
Gram Negatif (-) : berwarna merah
Gram Positif (+) : berwarna ungu
Pembahasan
Pewarnaan
garam adalah suatu metode untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok
besar , yakni gram positif dan gram negatif. berdasarkan sifat kimia dan fisik
dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan
Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada
tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella
pneumoniae (Iud W 2008).
Dengan
metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri
Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap
cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi
dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada
mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp Contoh
bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan
beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteribakteri dari kedua genus
ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding
selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel
terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai
oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram (Entjang I
2003).
Zat warna
adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam
terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa
kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel
bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai
dasar pewarnaan bakteri. Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu
asam dan basa. Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka
disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat
warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen blue, safranin, netral red,
dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4 -, CH3COO-,
COOHCOO. Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat
dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan
bagianbagian inti sel. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti
: fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat
warna penutup. Pada bakteri gram positif menunjukkan warna biru ungu dan
bakteri gram negatif berwarna merah.
Dalam
pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :
1. Zat
warna utama (violet kristal)
2. Mordan
(larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama
3. Pencuci
/ peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan
uantuk melunturkan zat warna utama
4. Zat
warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel
yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.
Bakteri
Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada
metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil
ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak.
Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan
setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna
merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua
tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.
Pengecatan
gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu :
1. Pemberian
cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.
2. Pengintesifan
cat utama dengan penambahan iod.
3. Pencucian
(dekolarisasi) dengan larutan alkohol 96%.
4. Pemberian
cat lawan yaitu cat warna safranin.
Pada proses
pewarnaan gram, harus gelas obyek yang bersih. Pembersihan ini dilakukan supaya
gelas obyek bebas lemak dan debu. Pembersihan biasanya menggunakan
alkohol . Setelah di cuci kemudian di beri satu tetes aquades pada permukaan
gelas obyek. Kultur bakteri murni diambil dan diratakan diatas kaca obyek.
Pengambilan kultur bakteri tidak diambil terlalu banyak, karena jika terlalu
banyak akan sulit diratakan dan apabila kultur bakteri tidak dapat diratakan
tipis-tipis maka bakteri akan tertimbun hal ini akan mengakibatkan pemeriksaan
bentuknya satu per satu menjadi tidak jelas.
Apabila
sudah kering, dilakukan fiksasi dengan cara melewatkan diatas nyala api. Proses
fiksasi dilakukan supaya bakteri benar-benar melekat pada kaca obyek sehingga
olesan bakteri tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Yang perlu
diperhatikan dalam proses fiksasi adalah bidang yang mengandung bakteri dijaga
agar tidak terkena nyala api. Setelah dilakukan fiksasi kemudian ditetesi
dengan kristal violet dan dibiarkan. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan
dibiarkan sampai kering (dengan cara dianginkan). Pencucian dengan air
bertujuan untuk mengurangi kelebihan zat warna dari violet kristal. Setelah
kelebihan zat warna dicuci dengan air kemudian diberi larutan iodin dan
dibiarkan sehingga terbentuk suatu kompleks antara violet kristal dan iodin.
Olesan bakteri kemudian dicuci kembali dengan air mengalir. Kemudian dicuci
dengan etanol dan dicuci kembali dengan air mengalir.
Pewarnaan
selanjutnya dengan menggunakan safranin dan diamkan. Kemudian cuci dengan air
mengalir dan kering dianginkan, kemudian diamati dibawah mikroskop.
Pemberian
kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda.
Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah
didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram
positif mengandung protein dan gram negative mengandung lemak dalam persentasi
lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Pemberian alkohol (etanol) pada
praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar
permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan
menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada
bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori
– pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna
safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu.
Perbedaan
dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding
selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran
sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari
dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan hilang
dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan
yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan peptidoglikogennya
tipis (1-3 nm).
Sifat
bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu
determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara
bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif.
Ciri-ciri
bakteri gram negatif yaitu:
1. Struktur
dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.
2. Dinding
selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam.
3. lapisan
kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit ± 10% dari berat kering, tidak
mengandung asam tekoat.
4. Kurang
rentan terhadap senyawa penisilin.
5. Pertumbuhannya
tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.
6. Komposisi
nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.
7. Tidak
resisten terhadap gangguan fisik.
8. Resistensi
terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat.
9. Peka
terhadap streptomisin.
10. Toksin
yang dibentuk Endotoksin.
Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:
1. Struktur
dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.
2. Dinding
selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang
sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan.
Mengandung asam tekoat.
3. Bersifat
lebih rentan terhadap penisilin.
4. Pertumbuhan
dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.
5. Komposisi
nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.
6. Lebih
resisten terhadap gangguan fisik.
7. Resistensi
terhadap alkali (1% KOH) larut.
8. Tidak
peka terhadap streptomisin.
9. Toksin
yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin
Berdasarkan
pengamatan pada sampel 1 morfologi sel berbentuk bacil dan morfologi koloni
streptobasil, sampel 2 morfologi sel berbentuk cocus dan morfologi koloni
streptococus, sampel 3 morfologi sel berbentuk bacil dan morfologi koloni
streptobacil, sampel 4 morfologi sel berbentuk bacil dan morfologi koloni
streptobasil dan sampel 5 morfologi sel berbentuk bacil dan morfologi koloni
streptobasil.
Simpulan
Berdasarkan
pengamatan dapat disimpulkan bahwa pada sampel 1 morfologi sel berbentuk bacil
dan morfologi koloni streptobasil, sampel 2 morfologi sel berbentuk cocus dan morfologi
koloni streptococus, sampel 3 morfologi sel berbentuk bacil dan morfologi
koloni streptobacil, sampel 4 morfologi sel berbentuk bacil dan morfologi
koloni streptobasil dan sampel 5 morfologi sel berbentuk bacil dan morfologi
koloni streptobasil.
Daftar Pustaka
Bailey and
Scott’s. 2007. Diagnostic Microbiology 12th edition.
Mosby Elsevier : Houston.
Entjang
I. 2003. Mikrobiologi dan Parasitologi Untuk Akademi Keperawatan.
Jakarta : PT. Citra Aditya Bakti
Iud W.
2008. Teknik dan Metode Dasar Dalam Mikrobiologi. Malang : UMM
Press
Jawetz,
Melnick, Adelberg. 2008. Mikrobiologi Kedokteran Edisi 23. Jakarta
: Penerbit Buku Kedokteran EGC
Prescott,
Harley, Klein’s. 2008. Microbiology 7th edition.
Boston : Published by McGraw-Hill
0 komentar:
Posting Komentar